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核磁共振光譜學

测定微观结构的一种谱学技术



此條目介紹的是核磁共振現象作為光譜技術的應用。關於其在醫學方面的應用，請見「磁共振成像」。

核磁共振光譜學（英語：Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy, NMR），簡稱核磁共振或核磁，是一門將核磁共振現象應用於測定物質微觀結構的分析技術與學說。物質是由原子構成的，量子力學研究發現，某些原子的原子核同時具有核磁矩與核自旋帶來的角動量，因此在強靜態磁場下與射頻電磁波會發生核磁共振現象，並產生能反映其內部結構的射頻電磁光譜反饋，即核磁共振光譜。[1]:5-38 研究者對所得的核磁共振光譜進行分析，需要時可以調整樣品製備、選擇或設計特定的射頻脈衝序列以獲得特定的資訊。

歷經半個多世紀的發展，隨着物理學界對核自旋動力學的理解逐漸深入，核磁共振光譜學產生出了眾多分支技術與學說，包括最初的氫譜與碳譜，以及後續逐步發展出來的多核核磁、固態核磁[2]、二維核磁、動態核磁、同位素標記核磁等，同時也已從最初的測定分子結構[3]拓展到更廣泛的各學科領域，包括材料學、晶體學[4]、生物化學[5]、分子生物學[6]、分子動力學[7]、高分子科學[8]、藥劑學[9]、環境科學[10]等。

歷史

早期

1920年代，物理學界通過斯特恩-革拉赫實驗等諸多實驗認識到了電子自旋的存在，人們猜測，若原子核也存在自旋性質，原子光譜里的諸多現象就能得到解釋。1939年，拉比等人將氫分子束置於靜態磁場下，並給予射頻電磁波輻射，發現某個特定頻率的電磁波被集中吸收了，這是人類史上首次探測到核磁共振現象。1946年，史丹福大學的布洛赫等人對核磁矩在核磁共振中的行為進行了推測，因此在樣品水旁放置了能探測射頻輻射的銅線圈，成功的檢測到了射頻能量的吸收；[11] 幾乎在同一時間，哈佛大學的珀塞爾等人也用相似的方法從一小塊樣品蠟中探測到了氫原子磁矩對於射頻輻射的吸收；[12] 這兩項實驗標誌着核磁共振開始從理論發展為一門技術。

1948年，布隆伯根等人發現了固態核磁與液態核磁的差異，即前者的信號頻率更寬，同時詮釋了核弛豫概念。[13] 1949至1950年，奈特等科學家分別通過對諸如氟-19與磷-31等其他核素的核磁實驗發現了化學位移的存在。[14] 1951年，帕卡德等人首次對乙醇進行了核磁實驗並得到了其氫譜，這一研究向學界揭示了核磁共振能成為分析化學領域內一個強有力的技術。[15] 1952年，由於光譜儀解像度的提高，人們發現了自旋-自旋耦合、純量耦合、化學交換等現象。[16] 同年，瓦里安聯合公司推出了首個商業化的核磁共振光譜儀。[17]

初步應用

1950年代中葉，核磁共振光譜學開始在有機化學領域內得到應用，關於類固醇、糖、生物鹼、紫質等有機化合物的核磁研究相繼發表，也推動了關於醣類分子手性的研究。[18] 同時，物理學界對於自旋相互作用的研究也在繼續，並得到了電腦程式的輔助。1961年，瓦里安公司的「Varian A-60」光譜儀問世，大幅提高了儀器的實用性並降低了成本。新一代的光譜儀採用了雙共振結構，允許對樣品同時施加兩個不同頻率的射頻場，一個可用於信號探測，另一個用於干擾樣品的核自旋系統，從而允許了去耦合（英語：Nuclear magnetic resonance decoupling）、核NOE效應（英語：Nuclear Overhauser effect）等改進光譜解像度的技術的運用。得益於此，碳-13核磁共振光譜學也從理論走向了實踐。[19]

1950年代末，海歸物理學家王義遒、丁渝、沈學礎等人將核磁共振光譜學帶入中國大陸，「光譜」這一譯名是丁渝提出的。[20]

1966年，瓦里安公司推出了「Varian HR-220」核磁共振光譜儀，是為首個應用低溫超導磁體的商業化光譜儀，大幅提高了核磁儀器的解像度。此後，牛津大學的理查茲（英語：Rex Richards (chemist)）與牛津儀器（英語：Oxford Instruments）以及布魯克公司（英語：Bruker）合作提高氫譜頻率至270MHz。[21] 同年，恩斯特等人在核磁實驗中運用射頻脈衝，並推廣了與傅立葉轉換技術，大幅提高了核磁實驗的靈敏度與效率。[22] 這兩項技術的出現，推動了複雜有機化合物的核磁研究，例如烷烴、多肽、低聚核苷酸等。同時，固態核磁的發展也有些許突破，約翰·沃（英語：John S. Waugh）與派因斯等人將新技術成功推廣到了固態領域。1971年，二維核磁的構想由吉納（英語：Jean Jeener）提出，並由恩斯特在1970年代中葉將其發展為一項實用技術。[19]

基本原理

核磁共振

主條目：核磁共振

核自旋

一個旋轉的物體具有角動量。在量子力學領域，自旋也是角動量的一種形式，然而它事實上並非由旋轉產生，而是粒子的一種內稟性質，並且是量子化的。原子核由中子與質子構成，兩者都具有 1/2 的自旋量子數，它們以各種數量組合構成了不同的核素。許多核素也具有自旋，核自旋量子數是由一個或多個質子與中子的自旋量子數   依照角動量疊加原理得到的，通常用   表示。同時，多個質子與中子以不同的方式疊加會產生不同的核自旋狀態，核自旋態之間的躍遷通常需要極高的能量（約1011 kJ/mol），因此大多數情況下核自旋處於基態，基態核自旋量子數具有下列規律：

  1. 質量數為奇數的核素具有半整數自旋，例如1H，13C；
  2. 質量數為偶數、且質子數與中子數均為偶數的核素，基態核自旋量子數為 0，例如12C、16O、56Fe；
  3. 質量數為偶數、且質子數和中子數均為奇數的核素，基態核自旋量子數為大於 0 的整數，例如2H、10B、14N。

一個具有量子數為   的核量子態具有   個摺疊簡併態，施加磁場時，簡併度會被破壞並分裂，這就是原子核的塞曼分裂。因此，諸如12C、16O等量子數為 0 的核素並不具有核磁共振行為。核自旋量子數為 1/2 的核素在核磁共振光譜學中最為重要。原子核自旋大於 1/2 的被稱為四極核，由於其塞曼分裂為兩個以上的能階，核磁共振研究會更加困難。[1]:5-15

常見核素的核磁性質[23]
核素 基態自旋
量子數 		豐度
（%） 		磁旋比  
（106 rad s-1 T-1）
1H 1/2 ~100 267.513
2H (D) 1 0.015 41.065
7Li 3/2 92.5 103.962
11B 3/2 80.1 85.847
13C 1/2 1.1 67.283
15N 1/2 0.37 -27.126
17O 5/2 0.04 -36.281
19F 1/2 ~100 251.815
23Na 3/2 ~100 70.808
29Si 1/2 4.7 −53.190
31P 1/2 ~100 108.394
35Cl 3/2 75.77 10.610
63Cu 3/2 69.17 71.118
12C 0 98.9
16O 0 ~100

核的磁性

磁性是物質與磁場發生作用的能力，通常由磁矩   定量描述，一個物體的磁能取決於自身的磁矩以及磁場的大小，即  。與自旋類似，各基本粒子也具有磁性的內稟性質，原子核的磁性則是由質子與中子的磁性經量子疊加得到的，其磁矩大小與自旋角動量成正比： ，其中   為磁旋比，單位為弧度每秒每忒斯拉（rad s-1 T-1），是不同的粒子所具有的特徵常數。[1]:23-26

進動與拉莫頻率

當帶有磁性的物體（例如一個指南針）被放置在磁場中時，磁矩的方向會旋轉至與磁場方向平行，以降低磁能。當原子核位於磁場中時，由於其同時具有角動量，角動量與磁場的方向（即極化方向）並不能與磁場方向保持平行，而是與磁場方向保持一定角度旋轉，如同在一個以磁場方向為軸的圓錐體上，這種運動方式被稱為自旋進動。

自旋進動的頻率被稱為拉莫頻率，與磁場大小和磁旋比成正比： ，單位為弧度每秒（rad/s）。若以赫茲（Hz）為單位，公式如下：

 

進動的方向與磁旋比相關，若磁旋比為正，拉莫頻率為負，進動方向則以順時針方向沿磁場方向旋轉，例如1H與13C，反之則為逆時針。[1]:26-30

共振電波

當施加射頻電波（通常為脈衝波）時，進動中的核自旋會感受到兩個磁場：靜態磁場和射頻電波的振盪場，前者的磁場強度會比後者大好幾個數量級，因此通常情況下射頻振盪場對核自旋狀態（如磁矩的方向與大小）並不會產生影響。然而，若施加的電波頻率與拉莫頻率相同，兩者就會發生共鳴，從而使得自旋狀態發生顯著變化。[1]:247 這種論述通常被稱為核磁共振現象的古典物理表述。[24]

弛豫

主條目：弛緩 (核磁共振)

在核自旋狀態的變化過程中，弛豫時間是的一個重要因素，對其運用能很大程度上反映原子或分子的微觀運動狀態。

核磁實驗

樣品處理

 
在薄壁玻璃管中的溶液態核磁樣品

核磁共振光譜儀通常由一個旋轉的樣品架，一個非常強的磁鐵，一個射頻發射器和一個接收器組成，探頭（天線組件）在磁鐵內部環繞樣品，可選擇用於擴散測量的梯度線圈和電子設備來控制系統。旋轉樣品是平均擴散運動所必需的。而擴散常數（擴散有序光譜法或DOSY）[25][26]的測量是在樣品靜止和離心的情況下進行的，流動池可用於在線分析工藝流程。

氘代NMR溶劑

NMR溶液中的絕大多數原子核屬於溶劑，大多數常規溶劑是烴，並含有NMR響應的質子。 因此，氘（氫-2）被取代（99+％）。雖然氘氧化物 (D2O)和氘代DMSO(DMSO-d6)用於親水分析物，氘代苯也是常見的，但氘代溶劑最常用的是氘代氯仿(CDCl3)。 取決於電子溶劑化效應，不同溶劑中的化學位移稍有不同。NMR光譜通常相對於已知的溶劑殘餘質子峰值，而不是添加的四甲基矽烷進行校準。

勻場與鎖定

為了檢測微弱的核磁共振射頻脈衝信號，整個樣品所處的靜態磁場必須是十分均勻的。高解像度核磁共振光譜儀會使用勻場片，將磁場的均勻性在幾立方厘米的體積內調整至十億分比。為了檢測和補償磁場中的不均勻性和擾動，光譜儀用一個單獨的鎖定單元保持對溶劑中氘頻率的「鎖定」，該單元本質上是一個額外的發射器和射頻處理器，調諧到鎖定核(氘)而不是樣品的原子核。[27] 在現代核磁共振光譜儀中，均場是自動化的，儘管在某些情況下，操作員必須手動優化勻場參數以獲得最佳解像度。[28][29]

光譜分析

化學位移

 
化學位移的實例：六硼烷B6H10的NMR譜圖顯示出頻率偏移的峰，這提供了分子結構的線索。（點擊閱讀解讀細節）
主條目：化學位移

在一個分子中，各個原子的化學環境有所不同，或多或少的受到周邊原子或原子團的屏蔽效應的影響，因此它們的共振頻率也不同，從而導致在核磁共振光譜上，各個質子的吸收峰出現在不同的位置上。但這種差異並不大，難以精確測量其絕對值，因此人們將化學位移設成一個無因次的相對值，即：某一物質吸收峰的頻率與標準質子吸收峰頻率之間的差異稱為該物質的化學位移，常用   表示，單位為 ppm（百萬分比）[30]。而在實際應用中，四甲基矽烷常被作為參照物，計算方法如下：

 

透過不同質子的化學位移，人們可以得出這些質子所處的化學環境，從而得出該分子的結構資訊，這種過程稱之為「解譜」。比如對於乙醇分子，具有三種不同化學環境的質子，即：甲基、亞甲基和羥基。在其1H譜圖上，可以看到3個特有的峰信號各自處於特定的化學位移，其中位於1 ppm的峰信號對應甲基，位於4 ppm的信號對應亞甲基，位於2~3 ppm之間的信號對應羥基，其具體化學位移值和採用的NMR溶劑有關。另外，從峰信號的強度可以得出相對應的質子數量，比如乙醇分子中的甲基擁有3個質子，亞甲基擁有2個質子，在譜圖上，對應的甲基和亞甲基峰強度比為3：2。

現代的分析軟件可以協助人們通過分析峰信號，從而得出究竟有幾個質子形成了此信號。這種方法稱作「積分」，即通過計算面積（不單單是高度，還有峰寬度）來得出相關質子數目。但必須指出的是，這種計算方法僅適用於最簡單的一維譜，對於更複雜的譜圖，比如13C譜，其積分還與原子核的弛豫速率和偶極耦合常數相關，而這些常常被人誤解。因此，用積分法來解析複雜核磁譜圖是相當困難的。

J-耦合

峰的裂分 強度比
單重 1
雙重 1:1
三重 1:2:1
四重 1:3:3:1
五重 1:4:6:4:1
六重 1:5:10:10:5:1
七重 1:6:15:20:15:6:1
 
作為信號強度相對於化學位移繪製的乙醇的1H NMR光譜（1維）的例子。 NMR中有三種不同類型的乙醇中的H原子。 -OH基團上的氫（H）不與其他H原子偶合併表現為單峰，但CH3-和-CH2-氫彼此被偶合，分別形成三重態和四重態。

在一維譜圖上，除峰信號數量，峰信號強度之外，還有一個有助於解析分子結構的資訊，即磁性原子核之間的J-耦合。這種耦合來源於臨近磁性原子核的不同自旋狀態數的相互作用，這種相互作用會改變原子核自旋在外磁場中進動的能階分佈狀況，造成能階的裂分，進而造成NMR譜圖中的信號峰形狀發生劈裂，信號峰的劈裂狀態可以得出分子內各原子和官能團之間的連接方式，以及臨近的磁性核數目。

兩個相鄰的氫核之間的耦合遵循一定的規則，n個氫核將把相鄰磁性核信號峰劈裂成n+1個多重峰，並且這n+1個多重峰之間的強度關係依照巴斯卡三角形規則。例如，乙醇分子中的甲基峰與相鄰的亞甲基耦合，呈三重峰狀，三重峰之間的強度比為1：2：1。不過如果一個氫核同時與兩個不同性質的氫核進行耦合，則不會得到三重峰，而是得到雙雙重峰（dd）。要注意的是，如果兩個磁性核之間相隔3個化學鍵以上，耦合就變得十分微弱，以至於不會出現峰的劈裂，但在芳烴和脂環類化合物中三鍵距離以上的長程耦合通常可以得到較複雜的劈裂峰。

19F與31P通常由於其擁有更大的自旋量子數而顯得不同，其餘類似，比如氫核與氘核（2D）之間的耦合將把信號峰劈裂為1：1：1。

二級耦合

上文提到的內容是在耦合常數和化學位移間隔相比很小的情況下描述的，如果耦合常數較高，或化學位移間隔小，那麼多重峰的情況將變得複雜，特別是兩個以上的磁性核進行耦合時，這可以通過增強多重峰當中的特定幾個峰，並以犧牲其他峰的代價進行解決，不過在高場譜（比如高頻譜）當中，這種現象並不明顯，因此提高核磁儀器的頻率可以避免此問題。

其中一些模式可以用約翰·波普(John Pople)發表的方法進行分析[31] ，儘管它的範圍有限。

隨着多重譜之間的頻率差增加，二階效應減小，使得高場譜（即高頻譜）NMR頻譜比較低頻譜顯示更小的失真。在早期的60 MHz頻譜比通常在200 MHz或更高頻率下工作的後期機器的頻譜更容易失真。

磁不等價

在芳烴化合物和非彈性分子（比如烯烴）中，常會遇到由於各質子的磁不等價性而帶來譜圖複雜性增加，這需要計算化模型來輔助分析。

二維核磁

相關譜

主條目：關聯性磁振頻譜

相關譜（Correlation Spectroscopy）是二維核磁光譜的一種，常常簡寫為COSY。其它二維譜還包括J頻譜（J-spectroscopy），交換頻譜（EXSY，Exchange spectroscopy），核奧伯豪澤爾效應頻譜（NOESY，Nuclear Overhauser effect spectroscopy），全相關譜（TOCSY，total correlation spectroscopy），近程碳氫相關（HSQC，Heteronuclear single quantum coherence），遠程碳氫相關（HMBC，Heteronuclear multiple bond coherence）等。二維譜在解析分子結構方面可比一維譜提供更多的資訊，特別是用一維譜解析複雜分子結構遇到困難的時候，二維譜可以提供幫助。歷史上首次二維譜實驗方法由比利時法語布魯塞爾自由大學（Université Libre de Bruxelles）教授讓·熱納（Jean Jeener）於1971年提出，之後其實驗操作由沃爾特·奧厄（Walter P. Aue），恩里科·巴托爾迪（Enrico Bartholdi）和理查德·恩斯特（Richard R. Ernst）完成，並於1976年發表[32]。

固態核磁

主條目：固態核磁共振光譜學

液體核磁樣品如果放在某些特定的物理環境下，是無法進行研究的，而其它原子級別的光譜技術對此也無能為力。但在固體中，像晶體，微晶粉末，膠質這樣的，偶極耦合和化學位移的磁各向異性將在核自旋系統佔據主導，在這種情況下如果使用傳統的液態核磁技術，譜圖上的峰將大大增寬，不利於研究。

目前已經有一系列的高解像度固體核磁技術被研發出來。高解析固體核磁技術包含兩個重要概念，即通過高速旋轉來限制分子自取向和消除磁各向異性，對於後者，最常用的旋轉方式是魔角旋轉（Magic angle spinning），即旋轉軸和主磁場的夾角為54.7°。

固體核磁技術常被用於膜蛋白，蛋白纖維和聚合物的結構探究，以及無機化學中的化學分析。但同樣可被應用於研究於樹葉和燃油。

生物分子核磁

蛋白質

利用核磁譜研究蛋白質，已經成為結構生物學領域的一項重要技術手段。X射線單晶繞射和核磁都可獲得高解像度的蛋白質三維結構，不過核磁常局限於35kDa以下的小分子蛋白，儘管隨着技術的進步，稍大的蛋白質結構也可以被核磁解析出來。另外，獲得本質上非結構化（Intrinsically Unstructured）的蛋白質的高解像度資訊，通常只有核磁能夠做到。

蛋白質分子量大，結構複雜，一維核磁譜常顯得重疊擁擠而無法進行解析，使用二維，三維甚至四維核磁譜，並採用13C和15N標記可以簡化解析過程。另外，NOESY是最重要的蛋白質結構解析方法之一，人們通過NOESY獲得蛋白質分子內官能團間距，之後通過電腦模擬得到分子的三維結構。

核酸

「核酸核磁共振」是利用核磁共振光譜學獲得關於多核酸如DNA或RNA的結構和動力學的資訊。截至2003年，所有已知RNA結構中近一半已通過核磁諧振譜學確定[33] 。

核酸和蛋白質核磁共振光譜相似但存在差異。核酸具有較小的氫原子百分比，這是在NMR光譜學中通常觀察到的原子，並且因為核酸雙股螺旋是剛性的且大致線性的，所以它們不會自行摺疊以產生「長程」相關性[34]。通常用核酸完成的NMR的類型是1H或質子NMR，13C NMR，15N NMR和31P NMR。 幾乎總是使用二維核磁共振光譜方法，例如相關光譜學（COSY）和總相干轉移光譜學（TOCSY）來檢測穿透式核耦合，核歐佛豪瑟效應（英語：Nuclear Overhauser effect）(Nuclear Overhauser effect)光譜法（NOESY）來檢測彼此在空間上靠近的核之間的耦合[35]。

醣類

醣類核磁共振光譜解決醣類結構和構象的問題。

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外部連結

 
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